摘要
α-黑色素细胞刺激激素（α-MSH）会触发褪黑激素产生，这是人体应对紫外辐射刺激的天然保护措施。皮肤暴露在紫外辐射刺激下会促进α-MSH的产生。因此，在身体受到紫外辐射刺激之前，先刺激褪黑激素的生物合成可预防紫外辐射诱导的皮肤癌症。[1]

天然的α-MSH在体内非常不稳定，因此作为治疗剂的α-MSH多是它的类似物。[2-4]其中MT-Ⅱ（图1），作为α-MSH的类似物，是一种环肽，不仅对酶的降解有良好的抗性，并且具有很强的效力。

因为MT-Ⅱ的现实意义和大规模生产需求，所以我们的工作重点是优化一种全自动的多肽合成途径，比如多肽序列的线性合成及最终在树脂上作肽的内酰胺化反应。在PurePep® Chorus多肽合成仪上，我们使用不同的肽合成策略全自动合成MT-Ⅱ，以探索最优合成条件。然后选择其中最优合成方式，利用PurePep® Sonata®+多肽合成仪对MT-Ⅱ进行合成放大。
 

实验结果
利用PurePep® Chorus多肽合成仪探索合成条件，在多次合成实验后发现，直接的合成方式并不是合成MT-Ⅱ的最优选择，因为直接合成过程总是会产生大量的天冬氨酰亚胺(aspartimide)副产物。因此，我们采取分步合成的方式，大大降低了副产物的产生，显著提高MT-Ⅱ粗品的纯度，并且发现其中方法G是最优的合成方式。

在优化合成方法后，利用PurePep® Sonata®+中试级多肽合成仪对其进行放大合成，最终在5 mmol的规模下成功合成了MT-Ⅱ。

这项工作结合了PurePep® Chorus 和 PurePep® Sonata®+两款多肽合成仪，并且表现出了强大的合成流程开发能力、稳定的合成方法转移放大效果。
 

结论
1 在PurePep® Chorus上实现MT-Ⅱ的全自动合成，包括侧链脱保护和树脂上环化
2 开发了合成的反应条件（方法G），以优化的耦合条件******限度减少副反应发生
3 该方法被成功转移到PurePep® Sonata®+进行扩大规模合成，并且保持了MT-Ⅱ的高粗品纯度
 

实验方法与分析
首先，通过多肽固相合成（SPPS）法，利用Fmoc/tBu保护方案，使用PurePep® Chorus（0.1 mmol）多肽合成仪多次合成MT-Ⅱ（Ac-Nle-Asp-His-dPhe-Arg-Lys-NH2），并对不同的合成方法进行评估；当合成规模达到5 mmol时，利用新型PurePep Sonata+大规模多肽合成仪继续进行扩大合成。

首先室温下利用两种不同的耦合方式（DIC/Oxyama和HCTU/DIPEA）在Rink Amide MBHA树脂（0.35 mmol/g）上合成全长线性MT-Ⅱ【方法A：5当量的氨基酸；5当量DIC；5当量Oxyma Pure；方法B：5当量氨基酸；5当量HBTU；10当量DIPEA】。使用含20%哌啶的DMF溶液脱保护5分钟，重复两次。因为可顺利合成，利用DIC/Oxyama耦合方式再次合成全长线性MT-Ⅱ，这次采用5分钟预活化步骤【方法C：5当量氨基酸；5当量DIC；5当量Oxyma Pure；对氨基酸作预活化处理】。在这些合成过程中，Alloc和OAll作为赖氨酸和天冬氨酸的侧链保护基，允许多肽在树脂上环化。最后通过0.2当量的Pd(PPh3)4和24当量的PhSiH混合在DCM溶液中，室温反应60分钟，选择性去除Alloc和OAll，反应后DCM清洗3次。树脂上的环化反应，采用5当量PyOxim和10当量DIPEA的耦合溶液，在DMF中于室温下反应60分钟。

但是上述的合成方法都会导致大量的天冬氨酰亚胺(aspartimide)形成。为了抵消这种副反应的发生，我们设计出了一种新的合成路线，采用一种可选择的正交保护基团。在这种新的合成路线中，全长线性MT-Ⅱ通过方法B在Rink Amide MBHA树脂（0.35 mmol/g）上合成两次，两次合成使用两种不同的侧链保护基团的组合，【方法D：Lys（Mtt）/Asp（2-phenylisopropyloxy）】【方法E：Lys（ivDde）/Asp（ODmab）】。从方法D的结果来看，相比于前面所提到的常规方法（方法A、B、C），这种方法可以有效的降低天冬氨酰亚胺(aspartimide)的产生。与此同时，也需要注意的是，这种方法因使用了含特殊保护基的氨基酸相对成本较高。另一方面，方法E结果并不理想，可能还需要更多的探索。

为了消除天冬氨酰亚胺(aspartimide)的形成，也为了发现每一步合成发生了什么，所以采用逐步合成的方法。因此，首先使用方法C在Rink Amide MBHA树脂（0.35 mmol/g）上合成0.1 mmol的线性MT-Ⅱ直到合成到组氨酸停止。在完成小试切割和分析之后，将合成树脂分成两份，每份0.05 mmol，然后使用两种不同的耦合方式【方法F：DIC/Oxyama和方法G：HCTU/NMM，5当量的氨基酸、5当量的HCTU、10当量的NMM】将其与天冬氨酸继续耦合，室温反应，并且先进行5分钟的预活化。在这个循环，当使用方法F的DIC/Oxyma耦合方式用于偶联天冬氨酸时会出现天冬氨酰亚胺(aspartimide)，而使用 HCTU/NMM的耦合方式则不会显著出现。为了避免在进一步形成天冬氨酰亚胺(aspartimide)，在该步去除正交保护基团，在树脂上进行环化。两个等分的树脂使用各自的耦合化学反应（方法F:DIC/Oxyma，方法G：HCTU/NMM）继续完成合成。
 

PurePep® Chorus
 

对各种方法进行比较，发现通过使用方法G在PurePep® Chorus多肽合成仪上合成MT-Ⅱ时天冬氨酰亚胺(aspartimide) 杂质明显减少。于是选择这种方式在PurePep® Sonata®+大规模多肽合成仪上进行5 mmol MT-Ⅱ的放大合成。再次使用Rink Amide MBHA 树脂（0.35 mmol/g），考虑到相关成本会随着多肽合成规模的扩大而增加，于是应用3倍的过量试剂进行合成，逐步合成分析。在此过程中发现D-Phe和Nle需要重复耦合以便提高偶联效率，这种方法与原先在Chorus上的方法略有调整。合成方法的其他方面保留了一致性，并且取得了非常好的结果。

合成完成后，使用DMF和DCM将树脂洗涤，干燥，然后利用TFA/EDT/H2O/TIS（94:2.5:2.5:1）室温切肽1小时，乙醚沉淀。将收集的多肽溶于水/乙腈溶液中，使用Shimadzu Prominence HPLC进行收率分析，采用C18，100 Å，5 μm，100 × 4.6 mm Kinetex 色谱柱（Phenomenex），流速1 mL/min，流动相A缓冲液使用含0.1%TFA的超纯水，B缓冲液使用含0.1%TFA的乙腈，用5-95%的B缓冲液进行梯度洗脱25分钟，214 nm波长进行检测。分子量分析采用Shimadzu LCMS-2020 Single-Quad质谱仪进行检测，C18，100 Å，5 μm，50 × 2.1 mm的色谱柱（Agilent），流速1 ml/min，流动相A缓冲液使用含0.1%甲酸的超纯水，B缓冲液使用含0.1%甲酸的乙腈，用5-95%的B缓冲液进行梯度洗脱20分钟。
 

PurePep® Sonata®+

参考文献
1. V. V. Ryakhovsky, G. A. Khachiyan, N. F. Kosovova, E. F. Isamiddinova and A. S. Ivanov, Beilstein J. Org. Chem. 2008, 4, 39.

2. F. Al-Obeidi, A. M. Castrucci, M. E. Hadley, V. J. Hruby, J. Med. Chem. 1989, 32, 2555–2561.

3. F. Al-Obeidi, M. E. Hadley, B. M. Pettitt, V. J. Hruby, J. Am. Chem. Soc. 1991, 111,3413–3416.

4. A. Todorovic, J. R. Holder, R. M. Bauzo, J. W. Scott, R. Kavanagh, Z. Abdel-Malek, C. Haskell-Luevano, J. Med. Chem. 2005, 48, 9, 3328–3336.

5. D0042170 From Small to Large Scale Optimizing and upscaling the synthesis of melanotan II (MT-II) - Melanocortin Receptor Agonist, on PurePep® Chorus and PurePep® Sonata®+.

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