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应用速递 | 通过流动诱导分散分析(FIDA)技术表征构象变化

    评估蛋白质和结合物的整体结构变化

 

蛋白质 - 小分子相互作表征

 

天然条件和微量样品检测

 

同时评估结合亲和力,构象变化和绝对大小

 

介绍

许多生物学过程通过蛋白与小分子或其他蛋白的相互作用进行调节。在许多情况下,这些相互作用会引起构象变化,该变化直接调节活性或提供新的结合位点,以促进建立高阶复合物。作为模型系统,本次实验我们使用了细菌性结合蛋白超家族的麦芽糖结合蛋白(MBP)。

 

MBP是麦芽糖糊精转运系统的可溶组分,驻留在革兰氏阴性细菌的周质中,在该细菌的周质中,它可以将其配体(Maltose,Maltotriose和Maltoheptaose)运送到膜结合的转运蛋白复合物。MBP的配体结合位点位于两个球状结构域之间。

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图1.(a)MBP(42.5 kDa)Apo状态(左,开放)以及与Maltose(360 Dalton)结合形成的麦芽糖结合态MBP(右,关闭);(b)MBP的开放式(浅蓝色)和封闭式(浅粉红色)结构的对比。

 

材料和方法

该实验采用FIDA Neo仪器,480 nm LED荧光检测模块(FIDABIO ApS)。 

  1. 耗材:FIDA标准毛细管(i.d.:75 µm,LT:100cm,Leff:84 cm)。

  2. 缓冲液:Tris缓冲液pH 7.4(20mm Tris,150mmNaCl,0.05%Tween)。

  3. 指示剂:MBP(4.3ug/mL,100nM), MBP用Atto 488 NHS (Sigma Aldrich)标记。

  4. 分析物:麦芽糖(O-α-D-Glucopyranosyl-D-glucose),0-1000 µM。

通过用分析物填充毛细管,然后注射指示剂与分析物共孵育混合物,在400 mbar下流经探测器进行样品分析。

 

结果

麦芽糖会引起麦芽糖结合蛋白的构象变化。

FIDA技术提供了对流体动力半径(Rh)的绝对测量,并用于测量与麦芽糖(0.3 kDa)结合后ATTO488标记的MBP(42.5 kDa)的尺寸变化。如图2A所示,在25°C下绘制了MBP表观Rh随麦芽糖浓度(0-1000 µM)变化的函数曲线。MBP的Rh从2.88nm降低至2.62nm,对应于0.26nm的ΔRh,清楚地表明结合后的结构变化(图2A)。结合数学模型,通过流体动力半径(Rh)变化的数据解析,该相互作用亲和力KD≈10 µM,与文献[1,2]报道一致。在图2中,显示了单独MBP和MBP-麦芽糖的叠加FIDA信号。在图2B中,指示剂峰在麦芽糖存在下变窄。利用FIDA 泰勒分散分布图的峰面积,可同时探测MBP的荧光强度在增加麦芽糖浓度时因MBP与麦芽糖结合发生的变化,即结合相关荧光强度变化(BRIC,Binding Realted Intensity Change)。它表明,MBP的荧光信号受麦芽糖结合的影响(图2B),利用BRIC信号可从第二个维度解析二者亲和力常数KD≈10 µM,从而实现结合测量的正交估计。

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图2.(A)由FIDA在25°C分析的MBP和麦芽糖之间的相关结合曲线。即MBP的Rh随麦芽糖浓度(0-1000 µM)变化的函数曲线。(B)与单独的MBP(实线)相比,当存在麦芽糖(虚线)时,指示剂峰的原始数据曲线变得更窄。

 

结论

本文的数据显示了如何使用FIDA技术对蛋白质的构象变化进行测量。FIDA通过测量蛋白质的流动性半径(5 µL样品消耗)来深入评估活性以及局部和全局蛋白质结构变化。在一个平台,同时采用2种方法解析分子互作亲和力常数,正交测量,相互验证。

 

 

分子互作与稳定性分析系统

 

 

FIDA技术无论在传统的生物大分子、小分子互作分析,还是三元复合物,血清、血浆、粗提物中互作分析都有很好的适用性,而且在一些传统互作技术具有挑战性的领域,例如免纯化样本、脂质体、外泌体、GPCR互作分析领域具有独特的优势,FIDA技术扩展了互作方法的应用领域,非常有利于实验平台进行分子互作仪器技术升级。

 

FIDA技术在分子质量表征方面同样优秀,一次运行只需4微升样品4分钟的时间即可获取多达8个质量参数,其中流体力学半径(Rh)和粘度(Viscosity)为绝对数值,黏性(Stickiness)是FIDA的独家指标,聚集和多分散系数(PDI)为量化参数。FIDA可以用在任何蛋白相关的实验,包括蛋白质控,蛋白稳定性筛选、制剂筛选等常规方向,还可在液-液相分离(LLPS),冷冻电镜样本制备质控、蛋白表达体系筛选等领域有很好的解决方案。

产品特点

1. 无固定相:溶液中直接检测分子相互作用

2. 无标记或荧光标记

3. 灵敏度:Rh范围0.5-500nm

4. 分辨率:检测到<5%Rh变化

5. 亲和力范围:pM-mM

6. 分析物上样体积:≤4μL

7. 每个数据点8个质控参数

8. 适用于各种样本类型,包括免纯化蛋白、无缓冲液限制

应用领域

 


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