表面等离子体共振 (SPR) 是一种广泛使用的无标记互作检测技术，用于研究生物分子的结合行为。自 20 世纪 90 年代商业化 ^[1] 以来，SPR 在技术开发和应用方面都取得了巨大进步。它已成为生物医学研究、生物传感器开发和药物发现的核心工具。在过去十年中，SPR 还与其他技术结合联用，例如电化学 (EC-SPR) ^[2]、液相色谱 (HPLC) 和质谱 (SPR-MS) ^[3]，并已用于气相痕量检测（SPR-气相检测）。近年来最重要的发展之一是 SPR Microscopy (SPRM)，这是一种将高分辨率光学显微镜与表面等离子共振相结合的技术。SPRM 兼具两种技术的优势，可直接对样品进行空间可视化定位分析，并实时测量结合亲和力和动力学。利用传统的（基于通道的）SPR技术，研究细胞膜蛋白与候选药物或其他配体的结合一直具有挑战性，因为从细胞中提取蛋白并将纯化的蛋白固定在 SPR 传感器上不仅耗时费力，而且改变了蛋白质的天然微环境。SPRM 通过将细胞直接固定在 SPR 传感器上，从而保持了蛋白质的天然状态，显著改善了此类测量的结果 ^[4]。此外，还可以确定和绘制每个细胞中膜蛋白的分布和局部结合活性。

在本技术说明中，着重介绍 SPRM 技术及其与传统 SPR 技术的比较。

1 传统（基于通道）SPR

基于流体通道的SPR检测模式是最常见的分子结合研究方法（图 1）。传感器顶部安装有多个通道的微流控模块，样品通过泵系统传输送到每个通道。配体分子被固定在每个通道的传感区域上，随后分析物分子被传输到每个通道中与特定配体结合。对每个通道的传感区域（紫色区域）的数据进行平均，以产生 SPR 传感图（如图 1 右侧所示）。每个通道在一次测量循环中都会生成一个传感图（或表面再生后的多个传感图），结合亲和力和动力学参数可从这些传感图中分析得出。

图 1 传统（基于通道）SPR模式

2 SPRM（高分辨率显微镜）

SPRM 是一种基于高分辨率成像的 SPR 模式。它提供明场光学图像和传感区域的 SPR 数据（亲和力和动力学常数）（图 2）。SPRM（例如 SPRm200）在图像的每个像素处生成一个 SPR 传感图，提供任何给定传感区域上结合事件的空间映射，并提供比传统 SPR 模式更多的信息。SPRM 不仅可用于传统的 SPR 结合分析测量，还可用于细胞对候选药物反应的异质性研究。由于其高空间分辨率（~ 1 µm），它可以监测和测量病毒、细菌的结合事件，而这些无法通过传统 SPR 模式直接测量。SPRM 在测量药物与天然状态下的膜蛋白相互作用方面尤其有效，因为蛋白质分子位于活细胞膜内。

图 2 基于高分辨率成像的SPR模式

细胞在传感器表面孵育或固定，分析物或药物分子被传输到传感区域。图 3 显示了传感器上药物分子与细胞之间相互作用的示例。实时 SPR 图像 (3B，蓝色图像) 表示细胞受体与药物分子的相互作用或结合反应 (粉红色区域)。通过明场图像 (3A，绿色图像) 选择感兴趣的区域，生成传感图 (3C) 并分析得出结合信息。当选择许多不同的细胞区域时，可以用具有统计意义的数据确定细胞和细胞膜的异质性。

图 3 SPRM 同时提供明场图像 (A) 和 SPR 图像 (B)。结合参数由传感图 (C) 得出

总之，SPRM 提供了一种独特的功能来可视化细胞膜的结合活性。与传统的基于通道的 SPR 模式相比，SPRM 还具有额外的优势，即可以通过空间映射细胞膜蛋白天然状态下的结合亲和力和动力学，从而提供更多生物学相关信息。由于其高空间分辨率，SPRM 可用于监测其他表面发生过程，例如标记有生物分子的纳米颗粒的结合或纳米颗粒包被药物的递送。

3 SPRM与SPR要点比较

4 SPRM 200介绍

SPRM 200是美国BI公司细胞原位分子互作动态分析系统

应用

小分子药物或抗体药物与细胞膜蛋白（受体、离子通道等）原位结合分析；抗体药物与单细胞或多细胞的结合筛选；细胞结合统计学分布分析，开展细胞异质性研究；细菌或病毒与抗性药物的相互作用；其他分子与细胞/活细胞层面原位相互作用研究。

功能

亲和力测定；动力学分析；同步于SPR测量的光学成像；药物对多细胞或单细胞作用的研究；细菌或病毒与抗性药物相互作用的纳米级观察。

特点无标记

• 实时定量

• 细胞膜蛋白原位分析

• 细胞膜上指定区域分析

• 细胞或细胞膜异质性研究

• 电化学联合分析

参考文献

1. Liedberg, B et al, Biosens. Bioelectron. 10, i-ix, 1995

2. Patskovsky, S et al, Analyst, 139, 596-602, 2014

3. Nedelkov, D and Nelson, R, Trends in Biotechnology, 21, 7, 301-305, 2004

4. Wang, W et al, Nature Chemistry, 3, 249-255, 2011