介绍
来自动物的肽毒素是离子通道的有效抑制剂，无论是作为治疗一系列疾病的药物还是作为药物研究的宝贵工具，都显示出巨大的前景。法国的一个研究小组已经探索了一种蝎子肽BeKm-1的荧光标记方法，这种肽可以抑制hERG离子通道。hERG离子通道与心脏活动有关，在开发新药时必须避免阻断它。研究小组的方法包括蛋白质-蛋白质对接研究，使他们能够识别肽链中适合标记的溶剂暴露残基。这使他们能够设计和测试保持天然肽的特异性和作用方式的类似物。
肽毒素——药物先导化合物和药物研发工具的金矿
来自陆地和海洋动物的肽毒素是研究离子通道在生理和病理条件下所起作用的宝贵工具。仅蝎子毒液就含有多达320种肽毒素，这些肽毒素作用于41种不同的离子通道(1)。几种毒素衍生的肽也已成为治疗糖尿病、高血压、慢性疼痛和其他疾病的药物，同时有数十种处于临床前开发或正在进行临床试验(2)。一个例子是FDA批准的多肽药物Prialt®或Ziconotide，这是一种合成的25个氨基酸的肽，发现于海蜗牛的毒液中，可以阻断N型电压门控钙离子通道。Ziconotide作为全身镇痛药，适用于鞘内吗啡不耐受或难治性慢性严重疼痛的患者(3)。成千上万的多肽仍有待研究，作为可能的药理工具或药物先导化合物(4)。
设计毒素靶向hERG离子通道
该领域的关键驱动因素是目标通道晶体结构的可用性和对毒素结合的研究，这为设计毒素类似物开辟了可能性。一个例子是hERG通道，它与EAG -1通道同属于EAG(ether-go-go)电压门控K+通道家族。
编码hERG通道的基因KCNH2突变可导致长QT间期延长综合征(LQT)， LQT综合征涉及心室复极延长，可导致心脏骤停。LQT也可由阻断hERG的药物引起，包括抗生素、抗精神病药物和抗组胺药。这种相互作用是药物开发的主要挑战，必须在开发过程的早期进行研究。
评估hERG的一个有力工具是以毒素肽BeKm-1 (IC50 =3.3 nM)形式存在的有效阻断剂，该毒素肽是从蝎子Buthus eupeus的毒液中分离出来的。法国Molsamcules Max Mousseron研究所、Pole d'expertise Biotechnology公司和Smartox Biotechnology公司合作设计了BeKm-1的荧光类似物，专门结合hERG通道，目的是开发能够保持正确结合和抑制该通道的荧光类似物(5)。
支持残基选择的模型
该团队开发了一个试验模型，使用四聚体hERG通道结构来预测BeKm-1与hERG外部部分的结合，以帮助识别肽毒素上暴露于溶剂中的残基，可用于连接化学基团。分子模拟研究表明，肽毒素的α-螺旋与hERG结合位点底部的疏水表面接触，并且N端 Arg-1和Arg-27的侧链在所有结合模式下都暴露于溶剂，因此决定选择这些残基进行化学标记。
BeKm-1类似物的设计与合成
该团队设计并合成了四种荧光BeKm-1类似物(图1)。BeKm-1的N端用于将连接物连接到三种类似物上:4-戊酸(+ 4个碳原子; linker 4)，6-叠氮己酸(+6个碳原子; linker 6)，或10-十一烷酸(+ 10个碳原子;linker 10)。所有这些连接子都兼容点击化学(linker 4和linker 10的炔功能，linker 6的叠氮化物功能)。第四个BeKm-1类似物是基于Arg-27的溶剂可及性，但由于Arg-27不参与hERG通道识别，残基被含有炔功能的点击化学兼容的Lys残基所取代。然后将带有额外间隔的Cy5染料基团连接到肽上。
在连接子偶联到36-mer BeKm-1序列的N端之前，在Symphony®X全自动多肽合成仪上使用Fmoc固相化学逐步合成多肽链。在BeKm-1 Lys-27中，野生型L-Arg-27残基被L-Lys(pentynoyl)-OH取代。间隔物GS在C端包含左丙炔甘氨酸(Pra)，在侧链上具有炔基功能，Cy5在N端通过肽键偶联。
所有多肽合成采用2-氯三甲基氯树脂。经过树脂裂解和脱保护，粗毒素类似物被折叠/氧化，并通过C18反相色谱(RP-HPLC)纯化。利用点击化学方法将Cy5 与连接子偶联得到Cy5- PEG3 -linker4- BeKm-1、Cy5- PEG5 -linker10- BeKm -1、Cy5-spacer- GS -linker6- BeKm -1和Cy5- PEG5 - BeKm -1 Lys275。所有产物均经反相高效液相色谱纯化。
类似物保留特异性和作用方式，但亲和力降低
利用非洲爪蟾卵母细胞中表达的hERG通道，对荧光标记BeKm-1的效果进行了评价。所有类似物均表现出剂量依赖性的外向电流抑制作用，但IC50值(60-80 nM)高于天然毒素肽(12 nM;图2). BeKm-1和四个类似物的Hill系数都接近于1，表明它们具有相同的作用模式。
天然BeKm-1及其类似物对hERG的特异性可以通过对密切相关的K+通道hEAG1缺乏影响来证实，而对一种抗BeKm-1抑制的突变形式的hERG进行的实验显示，天然肽及其类似物对hERG的特异性相似。总的结论是，这些类似物具有与天然肽相同的特异性和作用方式，但对hERG离子通道的亲和力较低。
一种开发设计毒素肽的有前景的方法
这项研究说明了蛋白质-蛋白质对接工具如何用于修饰毒素肽的设计，这些修饰毒素肽可以用作离子通道成像或生物化学纯化/表征中的报告分子。这样的方法也可以提供有价值的工具来研究新的候选药物对离子通道的不良副作用，表征肽毒素的作用模式，并为药物开发开辟新的可能性。
正如Smartox Biotechnology CSO和INSERM高级研究主任Michel De Waard博士所指出的那样，Symphony® X全自动多肽合成仪在这项工作中发挥了关键作用。“Symphony® X是我们在Smartox合成能力的宝贵补充。作为GPT产品的长期用户，我们不仅依赖于该仪器的坚固结构和可靠性能，而且在生产含非天然氨基酸和特殊化学物质的多肽时，该仪器提供了更大的灵活性。能够同时合成多种肽类似物是一个巨大的优势，使我们能够提高我们实验室多肽合成的效率和生产力。”
高通量多肽合成仪Symphony® X介绍
Symphony® X是由美国多肽合成仪领军品牌PTI（GPT）推出的经典产品，仪器24通道设计，采用固相合成的原理，可以同时合成24条不同序列的多肽。仪器具有40个氨基酸位、8个试剂瓶位，为客户的研究、优化和生产提供******的灵活性。
*24个平行的独立反应通道，可同时在多个RV上运行不同的合成规模、多肽序列和反应条件，或在运行其他项目时按需使用
*12个通道可作预活化
*反应溶液的实时紫外线监测，而不是混合过程中的废液检测，以控制脱保护时间，并尽量减少多余的废物，以获得更好的纯度和产量
*快速红外加热
*Single ShotTM单次添加技术，几乎没有死体积
References
1. Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level. Housley, D.M et al. 2017.
Neuropharmacology 127, 46–78.
2. Pharmacokinetics of Toxin-Derived Peptide Drugs. Stepensky, D. Toxins 2018, 10, 483;
doi:10.3390/toxins10110483.
3. Toxins in Drug Discovery and Pharmacology. Peigneur S & Tytgat J. Toxins (Basel). 2018 Mar 16;10(3). pii: E126. doi: 10.3390/toxins10030126.
4. de Souza, J.M., et al, 2018. Animal toxins as therapeutic tools to treat neurodegenerative
diseases. Front. Pharmacol. 9, 145.
5. Fluorescent analogues of BeKm-1 with high and specific activity against the hERG channel.
Vasseur, L et al Toxicon: X, Volume 2, April 2019, 100010
