由于共洗脱杂质的存在，对固相多肽合成法（SPPS）合成的亲水性肽——组蛋白H3（1-20）的纯化是一个艰巨的挑战。在这个分享案例中，我们展示了如何通过使用PurePep EasyClean （PEC）多肽纯化试剂盒和反向高效液相色谱法（RP-HPLC）进行正交肽纯化来提高肽的纯度和降低纯化过程中的溶剂消耗。
引言
肽相关的一些杂质存在，会显著影响药物研发的结果（例如假阳性结果），为保证临床级肽的高质量性和结果测定的高可靠性，有必要将这些杂质从活性药物成分中去除。
化学合成肽的纯化主要是通过传统的色谱方法进行，RP-HPLC是最常用的方法。此外，快速色谱法（flash）也是研究级肽纯化的通用方法。然而，这两种色谱技术可能会都会忽略共洗脱杂质的存在。
相比之下，Gyros Protein Technologies公司的正交纯化PurePep EasyClean（PEC）技术与传统色谱法不同，它基于化学选择性分离原理。首先在固相多肽合成（SPPS）过程最后添加无痕可裂解连接子（PEC-Linker）对全长目标肽进行修饰，而SPPS过程中的封端（Capping）确保了只有全长目标肽可以添加上PEC-linker，然后通过正交捕获和释放技术（catch-and-release）直接将目标肽从复杂的混合物中分离出来。
在这个案例中，我们通过使用PEC多肽纯化试剂盒（基础装）纯化组蛋白H3（1-20）肽的极性片段，并且验证了PEC和RP-HPLC的正交性。
讨论
PEC级肽
从图1（左）的色谱图来看，粗组蛋白H3（1-20）看起来似乎很纯净，但是一些缺失序列相应的峰却在质谱图中集中大量出现。其中主要的杂质是丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）和苏氨酸（Thr）缺失的序列。用0.1％HFBA进行HPLC分析显示出了潜在的峰，并且测定了粗品的纯度为29％。
图1（右）显示了PEC纯化肽的色谱图。仔细观察比较质谱图（右侧图1中的插图）发现PEC单次纯化有效地去除了共洗脱杂质，从而确保了分析结果的高可靠性。
由于七氟丁酸酐（HFBA）能够将目标肽从截短的序列中分离出来，因此利用HFBA增强的反向快速色谱法（flash）进行首次纯化并与PEC纯化进行比较。采用该方法后，粗品纯度只提高到了66％（表2）。而使用PEC多肽纯化试剂盒纯化之后，纯度达到了86％。
利用PEC获得临床级肽
接下来，我们利用RP-HPLC进行对上述两种方式纯化的肽进行二次纯化，以获得临床级肽。纯度分别从29％（粗品）提高到了85％和96％（表2）。由此可见，PEC在与RP-HPLC的正交组合纯化肽中表现出了非常优异的纯化效率。
节省溶剂消耗
色谱分离会消耗大量的有机溶剂，减少溶剂的使用是改善肽纯化生态足迹的关键点。
ACN的消耗量是评估正交法生态效益的合理指标。由于PEC的捕捉和释放（catch-and-release）原理，纯化肽只需要使用少量的有机溶剂，并且产生的废物更少。在整个肽纯化过程中，仅积累了50 ml 的ACN和200 ml 的总废料。
而快速色谱法（flash）纯化则需要500 ml 的ACN，并且产生总计1500 ml 废料。相比之下，PEC纯化从整体上节省了85％以上的溶剂使用并大量减少废料生成。
当考虑结合RP-HPLC进行二次纯化时，额外需要添加1000 ml 的ACN并且总废料生成增加了3000 ml。
总体来看，正交PEC纯化与RP-HPLC法结合，可以节省约30％的昂贵溶剂消耗并且大大减少有害废料的产生。
结果
1 PEC纯化可以在单个正交纯化步骤中可以有效去除共洗脱截断序列
2 正交PEC和RP-HPLC结合获得了具有挑战性的超高纯度的肽
3 通过正交PEC纯化，可节省高达85％的溶剂使用并大量减少总废料生成
